請問加減法測定DNA序列時是怎麼從放射自顯影的圖譜上讀出序列的?

題目：

請問加減法測定DNA序列時是怎麼從放射自顯影的圖譜上讀出序列的?

解答：

DNA序列測定技術（雙脫氧末端終止法）使用須知
(張宏、李振甫)
一、背景介紹
目前最常用的手工DNA序列測定技術,仍然是Sanger等(1977)提出的酶法,也稱雙脫氧末端終止法.這種方法生成相互獨立的若干組帶放射性標記的寡核苷酸,每組核苷酸都有共同的起點,卻隨機終止於一種(或多種)特定的殘基,形成一系列以某一特定核苷酸爲末端的長度,各不相同的寡核苷酸混合物,這些寡核苷酸的長度由這個特定鹼基,在待測DNA片段上的位置所決定.然後通過高解析度的變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,經放射自顯影后,從放射自顯影膠片上,直接讀出待測DNA上的核苷酸順序.
高解析度變性聚丙烯醯胺凝膠電泳,亦是DNA序列測定技術的重要基礎,可分離僅差一個核苷酸、長度達300-500個核苷酸的單鏈DNA分子.DNA序列測定的簡便方法,爲詳細分析大量基因組的結構和功能奠定了基礎,時至今日,絕大多數蛋白質胺基酸序列都是根據基因或cDNA的核苷酸序列推導出來的.
除傳統的雙脫氧鏈終止法外,自動化測序實際上已成爲當今DNA序列分析的主流.此外,新的測序方法亦在不斷出現,如上世紀90年代提出的雜交測序法等.
二、雙脫氧末端終止法測序步驟
(一)製備模板
有兩種類型的DNA可以作爲Sanger法測序的模板,即純化的單鏈DNA和經熱變性或鹼變性的雙鏈DNA.
1、單鏈DNA模板 在一般情況下,可將靶DNA片段克隆於M13mp載體中,從M13mp系列噬菌體顆粒中分離得到的單鏈DNA模板效果最佳,只要細心掌握模板與引物的最佳比例,有經驗的測序人員通過一次末端終止反應,能讀取300-500個核苷酸序列.
2、經熱變性或鹼變性的雙鏈DNA模板 利用雙鏈質粒模板測序,其中有兩個至關重要的因素,即模板的質量和聚合酶的種類.用小量製備的質粒DNA來測定未知序列的DNA克隆,往往因爲有汙染而並不可取.高純度的質粒最好採用氯化銫-溴乙錠梯度平衡超速離心法製備.其次是應採用高質量的聚合酶.一次末端終止反應亦可能讀出300核苷酸序列.
(二)引物
酶法測序反應中都有一個與模板鏈特定序列互補的寡核苷酸作爲DNA合成的引物.不管是單鏈DNA作模板,還是用變性雙鏈DNA作模板,都有通用引物可用,而不必另行設計與未知DNA序列互補的引物.通用引物可直接從廠商購買.
（三）DNA測序酶
該酶是一種經過化學修飾的T7噬菌體DNA聚合酶,是測定較長DNA的首選酶.市售的各種以該酶爲基礎的測序試劑盒,效果甚佳.
(四)放射性標記
傳統的DNA測序方法都採用α-32P-dNTP作爲放射性標記物,但由於32p發射的高能β射線,常會引起二個問題：首先是放射自顯影圖譜條帶擴散、解析度低,限制了識讀序列的數量和準確性；其次是32P衰變會導致DNA樣品分解,通常都應在測序反應後24小時內進行電泳,否則無法獲得好的結果.
近年來α-35S-dNTP被廣泛採用,是由於35S產生較弱的射線,克服了32P的二大缺點.放射自顯影圖譜具有較高的解析度和較低的本底,測序反應產物可在-20℃保存一周,而解析度並不下降.
（五）測序膠的準備及電泳
1、矽化玻璃板
2、配置電泳試劑和緩衝液
3、凝膠液的配置
4、電泳
5、電泳後凝膠的處理
(六)DNA序列的識讀
DNA序列的識讀: ①在顯影前後一定要注意標明模板名稱、日期和測序人等,並標明各套反應位置；②識讀時從顯而易見的特徵序列開始,如連續的同聚核昔酸(如TTTTT、AAAAA)或交替出現的嘌呤和嘧啶(如GTGTGTGT),一旦找到這種序列,便可較快地確定目的序列的位置.
三、注意事項
儘管核酸序列測定方法越來越成熟、簡便並且可以自動化,但事實上,對於一個片段較長、序列未知的待測核酸而言,仍然是一件耗時且繁瑣的工作.對於一個待測DNA分子,要制定一個能夠簡捷準確的測定方案,一般可以從以下幾個方面考慮：
1、DNA片段大小.
2、背景資料：是否清楚DNA限制性酶切圖譜,是否有一段已知序列,是否具有重複序列等.
3、測序目的: ①測定未知序列；②確定重組DNA的方向與結構；③對突變(如點突變)進行定位和鑑定；④比較性研究,如比較同種病毒不同株系之間的基因差異.後3種測序目的稱爲確證性測序.
4、實驗條件：如手工測序還是自動化測序,合成引物費用等.
由於單套測序反應所能準確測定的DNA序列最長一般僅300-400bp.因此,在進行序列測定之前,必須首先考慮待測DNA分子的大小,其次是所要測定的序列範圍以及要求的序列精確程度等,再結合實驗室的條件選擇切實可行的克隆及測序方案.
DNA序列如何測定
一、常規DNA測序的原理
製作物理圖譜的過程是一個逐步精細的過程.第一步把每條染色體分成平均長度在400kb的長片段,每段克隆到一個YAC上,所有YAC克隆都按照其在染色體上的實際位置進行排序,我們就得到了一個能夠覆蓋整個染色體的YAC文庫.
把每一個YAC克隆攜帶的染色體片段經部分酶切形成一系列有重疊區域的40kb左右的片段克隆到粘粒上,得到粘粒文庫.每個粘粒上的染色體片段再經酶切形成4kb左右的片段克隆到測序專用的質粒載體上.測序質粒上攜帶的4kb的片段就可以用現在常規測序的方法進行測序了.把所有質粒克隆的DNA片段序列讀出,再按照各個片段在染色體上的實際位置進行排列,最後就可以得到染色體的全部核苷酸鹼基對序列.染色體的DNA鹼基序列是基因組物理圖譜的最精細形式.
所謂「常規測序方法」的基本特點有兩個：第一,把待測序的DNA分子進行處理,得到每個只差1個核苷酸的一系列逐步縮短的DNA分子的混合物；第二,通過凝膠電泳把這些DNA分子分離開來,形成階梯狀排列的條帶,然後逐個讀出DNA的鹼基序列.
二、化學法測序
得到長度只差一個鹼基的DNA分子的方法主要有兩種.一種是用化學方法把待測序的DNA片段在每個鹼基處切斷一次.這是由Maxam和Gilbert發明的方法.具體做法是把待測序的DNA分子成單鏈分子,其5』端用32p進行放射性標記.然後把這些單鏈DNA分於分成4份,每份用一種化學試劑處理DNA片段,每種試劑可使DNA分子在一種鹼基的5』端的磷酸二酯鍵處發生斷裂.例如,試劑一可使單鏈DNA分子在A鹼基處斷裂,試劑二可使單鏈DNA分子在T鹼基處斷裂,依此類推.把反應條件控制好,使每個DNA分子只發生一次斷裂,這樣,我們就得到4種反應產物,每種由在一種鹼基處發生斷裂形成的DNA片段組成.
把這4種反應產物用聚丙烯凝膠電泳進行分離,兩個DNA片段只要相差1個鹼基,就可以在這種凝膠中被分成兩個條帶.電泳完成後,用X光膠片進行曝光,最後得到一張由不同條帶組成的序列圖.從這張圖上就可以讀出待測DNA片段的鹼基序列.5』端的第一個鹼基G讀不出來,可以通過測定互補鏈的序列測出這個鹼基.
三、酸法測序與測序的自動化
另外一種得到長度只差一個鹼基的DNA分子的方法是英國科學家桑格發明的,這種方法利用DNA聚合酶以待測序的DNA單鏈分子爲模版合成互補的新鏈.在合成新鏈時,合成原料除了4種脫氧核糖核苷酸外還加入一種2』和3』位上的羥基都脫除的核苷酸.由於缺少3』羥基,當這種核苷酸被結合到鏈上後,它的後面不能再結合其他核苷酸,鏈的合成就此終止.與化學法測序類似,我們可以準備4種反應物,加入的核苷酸類似物分別攜帶A,G,C,T鹼基,每種反應物里包含在一種鹼基處終止鏈延伸的長短不同的DNA片段.這些DNA片段也要用放射性標記,經過凝膠電泳和放射自顯影,得到DNA條帶圖譜,根據圖譜可以讀出DNA的鹼基序列.
這種方法比化學法簡單,條件易於控制.用4種不同的螢光化合物分別標記4種反應的產物,就可以做到把4種反應物混合在一起進行電泳,可以提高電泳分析的效率.這種方法利用現代精密儀器和機器人技術可以實現DNA測序的高度自動化.目前市場上已經有各種型號的DNA自動測序儀可供選購.
根據最新計劃,到2000年人類基因組的「草稿」要出來.這個「草稿」包含了90％的人類基因組的序列,每個區域測定5次左右.到2003年完整的人類基因組序列測定可以完成,這個序列可以作爲「參考基因組」或者「標準基因組」用於生物醫學研究.測定這個「標準基因組」所用的DNA是由10到20位志願者提供的,用男性的精子DNA和女性的血液DNA作爲樣品構建了人的基因組文庫,因此,「標準基因組」序列不是哪一個具體的人的序列,而是幾十位志願者的序列的綜合體現.
四、單分子螢光測序
單分於螢光測序是一種快速DNA測序法,這是利用單分子操作技術直接讀取DNA的鹼基序列的方法,與傳統的螢光測序法相比,這種方法可大大提高速度.用桑格測序方法現在每天可以解讀上萬個鹼基序列,但是如果單分子螢光測序取得成功,它可以在兩分鐘內完成傳統方法一天的工作.
單分於螢光測序的主要過程如下.第一步,取一條大約有5萬個鹼基那麼長的單鏈DNA分子,把它的一端用化學方法連接在一個非常微小的塑料球上,DNA分子就會纏繞在塑料球上.第二步,在一張類似雷射唱片的圓盤上鋪一層很薄的液體薄膜,然後用雷射光鉗把塑料球放在這張光碟的液體膜上進行移動,DNA分子就會在後面被拖著展開,就好像一隻船拖著一條繩子快速前進,把繩子拉展一樣.第三步,讓拉展的的DNA分子與一種核酸外切酶結合.這種核酸外切酶可以和DNA的游離的末端結合,然後逐個把DNA的鹼基切割下來.第四步,用單分子光譜技術逐個識別並且讀出鹼基即達到了測序的目的.
目前,單分子螢光測序技術還沒有完全成熟.主要問題是用於識別單個鹼基的單分子光譜技術還沒有過關.利用隧道掃描顯微鏡和原子力顯微鏡直接讀取DNA分子鹼基序列的研究也正在進行之中,近期內有可能取得突破.
五、DNA晶片與雜交測序
DNA晶片是一種通過雜交測定未知DNA序列的新技術.在一個玻璃或矽片上合成大量的寡聚核苷酸片段,例如可以合成8個鹼基長的全部可能的寡聚核苷酸片段（48＝65,536種）.這些探針一頭固定在固體基質上,另外一端是游離的.它們在矽片上有規律地排列著,每個特定位置上探針的序列都是已知的.
假如有一個DNA片段需要測序,我們可以把它的單鏈形式用螢光進行標記,然後與矽片上的6萬多種探針進行分子雜交,在螢光顯微鏡下觀察雜交結果.如果某個探針與持測DNA的某個部分的序列是完全互補的,待測DNA分子就被結合到矽片上,這個探針所在的位置就會發出螢光.這種包含大量的生物遺傳信息的寡聚核著酸陣列就叫DNA晶片,也叫基因晶片.
DNA晶片的製備要利用微電子晶片生產中的光刻技術以及在位組合化學技術.DNA晶片的閱讀要使用顯微術,信息的解讀要利用計算機技術.因此,DNA晶片是多學科交叉的產物.