請問昆蟲細胞如何培養?昆蟲杆狀病毒表達系統是如何構建的?謝謝!

題目：

請問昆蟲細胞如何培養?昆蟲杆狀病毒表達系統是如何構建的?謝謝!

解答：

細胞的培養
細胞的生長需要一定的營養環境,用於維持細胞生長的營養基質稱爲培養基.培養基按其物理狀態可分爲液體培養基和固體培養基.液體培養基用於大規模的工業生產以及生理代謝等基本理論的研究工作.液體培養基中加入一定的凝固劑(如瓊脂)或固體培養物(如麩皮、大米等)便成爲固體培養基.固體培養基爲細胞的生長提供了一個營養及通氣的表面,在這樣一個營養表面上生產的細胞可形成單個菌落.因此,固體培養基在細胞的分離、鑑定、計數等方面起著相當重要的作用.從多細胞生物中分離所需要細胞和擴增獲得的細胞以及對細胞進行體外改造,觀察,必須首先解決細胞離體培養問題,同微生物細胞培養的難易相比,比較困難的是來自多細胞生物的單細胞培養,特別是動物細胞的培養.
設施器材
設施：淨化工作檯、恆溫培養箱、倒置顯微鏡、液氮儲存罐、電熱鼓風乾燥箱、冰櫃、電子天平、恆溫水浴箱、離心機、壓力蒸汽消毒器.
器材：
一、玻璃器材
無菌室
培養皿、滴流瓶、刻讀吸管、離心管、培養瓶、燒杯、量筒、三角燒瓶
二、塑料器材
多孔培養板、培養皿、培養瓶
三、橡皮器材
橡皮製品(最好是矽製品)做各種瓶或試管的塞子、蓋子.
四、金屬器材
剪刀、鑷子、手術刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號針頭
五、其他物品
紗布、注射器和針頭
培養基
(一)簡介
細胞的生長需要一定的營養環境,用於維持細胞生長的營養基質稱爲培養基.培養基按其物理狀態可分爲液體培養基和固體培養基.液體培養基用於大規模的工業生產以及生理代謝等基本理論的研究工作.液體培養基中加入一定的凝固劑(如瓊脂)或固體培養物(如麩皮、大米等)便成爲固體培
培養基
養基.固體培養基爲細胞的生長提供了一個營養及通氣的表面,在這樣一個營養表面上生產的細胞可形成單個菌落.因此,固體培養基在細胞的分離、鑑定、計數等方面起著相當重要的作用.從多細胞生物中分離所需要細胞和擴增獲得的細胞以及對細胞進行體外改造,觀察,必須首先解決細胞離體培養問題,同微生物細胞培養的難易相比,比較困難的是來自多細胞生物的單細胞培養,特別是動物細胞的培養.
(二)幾種常用溶液的配製方法
1、無鈣、鎂、離子溶液(1000ml)
氯化鈉(NaCl)8g磷酸二氫鈉、(NaH2PO4H20)0.05g、氯化鉀(KCl)0.2g、碳酸氫鈉(NaHCO3)1g、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g、葡萄糖1g、加去離子水或雙蒸水至1000mL
2、磷酸鹽緩衝液
甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液、磷酸氫二鈉(無水)28.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL
乙液：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液、磷酸二氫鈉(無水)2.4g、氯化鈉8.77g加去離子水或雙蒸水至1000mL
甲、乙液於4℃保存,使用時按表3-2所示比例,配製成所需pH濃度,高壓滅菌後室溫保存.
3、Hanks液
(1)母液甲(20x)配法
①NaCl(A.R)160g、KCl(A.R)8g、MgSO4.7H2O（A.R)2g、MgCl.6H2O(A.R)2g依次溶於800mL雙蒸水中,前一物質溶後再加後一種.
②CaCl2(A.R)2.8g溶於100mL雙蒸水中,溶時不斷攪拌（此液應單配,單溶）.
待上述兩溶液中的「溶質」全溶後,將它們混合,再用雙蒸水補至1000mL,向其中加2mL氯仿作爲防腐劑,置4℃保存.
(2)母液乙(20×)配法
①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g、KH2PO4(A.R)1.20g、葡萄糖(A.R)20.0g溶於800ml雙蒸水中.
②0.4%酚紅液0.4g酚紅放在玻璃研鉢後加0.01N、NaOH11.28mL,直到全部溶解,移入100mL容量瓶中,加水至100mL,過濾,pH爲7.4,4℃保存.
待上述各「溶質」完全溶解後,用雙蒸水補至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑,置40℃保存.
3)使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份,加雙蒸水18份,分裝後,塞好瓶塞,掛上標誌.以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞),置室溫後4℃保存,可使用幾個月.臨用前,用7.5%NaHCO3調至所需pH.
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細胞培養的一般條件
簡言之,既細胞需要什麼就提供什麼,道理是如此,真正能做到這點尚需時日,人們至今對細胞的生命周期控制機理認識不足,癌細胞雖然也來自正常細胞,但至今不知道究竟爲什麼癌細胞很難停止已經啓動的有害分裂,儘管如此,人們長期的研究結果表明,離體細胞培養需要的基本條件就是下列細胞生理條件.
(1)溫度
溫度過低時細胞生長緩慢甚至不生長.利用冷凍保藏細胞可保持細胞的原有分裂分化能力.溫度過高導致細胞死亡.這主要是由酶和蛋白質所需要的最適溫度決定的.多數生物大分子遇到高溫後容易導致空間結構改變或者喪失（變性）.細胞膜遇到高溫後容易變態.在自然界,即有耐高溫的
恆溫培養箱
細胞,也有耐低溫的細胞.在極端情況下生長的生物對付極端環境的機制研究在生物進化和農業、環保、發酵工業中意義重大.
(2)pH
過酸或過鹼可導致細胞死亡.這主要與蛋白質的變性和細胞膜的結構受損有關.
(3)滲透壓
細胞內外可溶於水的物質比例和種類決定細胞的膨脹與收縮程度,因爲細胞膜是半透膜,只允許對自己有利的物質通過.同一物質在細胞內外的分布的數量不同,當某一種極溶於水的物質在細胞外濃度過大時,有可能導致細胞乾癟死亡,這些物質在細胞內過多時導致細胞過量吸水膨脹.細胞膜調節滲透壓的能力是有限的.
(4)營養物
營養物和水一起,又叫細胞培養液,培養液中含有細胞增殖和生長所需要的各種物質.營養物包括：N 源、C源,這些物質與提供能量有關；無機鹽、維生素、激素,這些物質與代謝調節控制有關.細胞培養液的設計一直是細胞離體培養技術的關鍵.理想的細胞培養液可以同時解決細胞離體培養所需要的pH、滲透壓、營養物、調節物質的全部需要.在幹細胞分化研究與應用中,關鍵是找到一種使幹細胞分化成爲所需細胞和組織的營養液.相同的人幹細胞,放在不同的營養液中分化培養出人的各種臟器,這個昔日的夢想已經開始成爲現實.植物細胞的組織培養技術已經基本完善配套.名貴花卉、中草藥、脫毒馬鈴薯、組織培養蓮菜苗等植物細胞與組織培養技術的不斷完善,特別是由於組織培養液的商品化已經被廣大農民普遍接受.
(5)水
水是細胞需要數量最大的物質,不同的物種、不同部位、不同生長期的細胞含水量差別相當大.乾旱植物細胞的含水量高達90%.水的需求量一般隨同細胞培養液一起考慮.
(6)無菌條件
體外細胞培養僅僅是對所需的細胞進行培養,但環境中（如空氣）有各種其他微生物,必須對所需細胞進行無雜菌的隔離培養.無菌條件是細胞離體培養最基本的條件.
(7)光
植物細胞和少數細菌需要利用光進行光合作用.
(8)氣體
動物細胞需要不斷供給氧氣和排除二氧化碳,植物細胞與此相反.
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動物細胞培養的特殊條件
在所有的細胞離體培養中,最困難的是動物細胞培養.下面是它所需要的特殊條件.
(1)血清：動物細胞離體培養常常需要血清.最常用的是小牛血清.血清提供生長必需因子,如激素、微量元素、礦物質和脂肪.有一天人們真正學會了配製和血清一樣的培養液,那時血清才可被取代.在這裡,血清等於是動物細胞離體培養的天然營養液.
(2)支持物：大多數動物細胞有貼壁生長的習慣.離體培養常用玻璃,
高速冷凍離心機
塑料等作爲支持物.
(3)氣體交換：二氧化碳和氧氣的比例要在細胞培養過程中不斷進行調節,不斷維持所需要的氣體條件,每一次開箱操作後的快速恢復對設備的要求可想而知有多難?由此決定了動物細胞離體培養設備要求高、投資大.
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植物細胞培養的特殊條件
(1)光照：離體培養的植物細胞對光照條件不甚嚴格,因爲細胞生長所需要的物質主要是靠培養基供給的.但光照不但與光合作用有關,而且與細胞分化有關,例如光周期可對性細胞分化和開花調控作用,所以以獲得植株爲目的的早期植物細胞培養過程中,光照條件特別重要.以植物細胞離體培養方式獲得重要物質,如藥物的過程,植物細胞大多是在反應器中懸浮培養.
(2)激素：植物細胞的分裂和生長特別需要植物激素的調節,促進生長的生長素和促進細胞分裂的分裂素是最基本的激素.植物細胞的分裂,生長,分化和個體生長周期都有相應的激素參與調節.和動物細胞相比,植物細胞離體培養對激素要求的原理已經了解,其應用技術也已相當成熟,已經有一套廣泛作爲商品使用的培養液.同時解決了植物細胞對水、營養物、激素、滲透壓、酸鹼度、微量元素等的需求.
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微生物細胞培養的特殊條件
微生物多爲單細胞生物,野生生存條件比較簡單.所以微生物人工培養的條件比動植物細胞簡單得多.其中厭氧微生物培養比好氧微生物複雜,因爲嚴格厭氧需要維持二氧化碳等非氧的惰性氣體濃度,而好氧微生物則只需要通過不斷攪拌提供無菌氧氣.微生物對培養條件要求不如動植物細胞那樣苛刻,玉米漿、蛋白腖、麥芽汁、酵母膏等成爲良好的微生物天然培養基.對於一些特殊微生物的營養條件要求,可以在這些天然培養基的基礎上額外添加.
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注意事項
1、實驗進行前,無菌室及無菌操作台(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌,以70%ethanol擦拭無菌操作擡面,並開啓無菌操作颱風扇運轉10分鐘後,才開始實驗操作.每次操作只處理一株細胞株,且即使培養基相同亦不共享培養基,以避免失誤混淆或細胞間汙染.實驗完畢後,將實驗物品帶出工作檯,以70%ethanol擦拭無菌操作擡面.操作間隔應讓無菌操作台運轉10分鐘以上後,再進行下一個細胞株之操作.
2、無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞,必要物品,例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置,其它實驗用品用完即應移出,以利於氣流之流通.實驗用品以70%ethanol擦拭後才帶入無菌操作台內.實驗操作應在擡面之中央無菌區域,勿在邊緣之非無菌區域操作.
3、小心取用無菌之實驗物品,避免造成汙染.勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,亦不要在打開之容器正上方操作實驗.容器打開後,以手夾住瓶蓋並握住瓶身,傾斜約45°角取用,儘量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面.
4、工作人員應注意自身之安全,須穿戴實驗衣及手套後才進行實驗.對於來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作,並選擇適當等級之無菌操作台(至少ClassII).操作過程中,應避免引起aerosol之產生,小心毒性藥品,例如DMSO及TPA等,並避免尖銳針頭之傷害等.
5、定期檢測下列項目：5.1.CO2鋼瓶之CO2壓力5.2.CO2培養箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有汙染(水盤的水用無菌水,每周更換).5.3.無菌操作台內之airflow壓力,定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜,預濾網(300小時/預濾網,3000小時/HEPA).6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750),定期更換水槽的水
6、粉末培養基配製好後(加了血清),一般在4度儘量不要超過1個月,如在-20度存放時間可長一些,但最好也不要超過3-4個月,可能對於永生化細胞株來說要求不是太高,細胞嬌弱,放置時間不宜過長.
7、開紫外線照射台的時候,就將培養基、酶、DHANKS液那到室外讓它自然升溫.這樣40分鐘後,溫度也升上來了.有很多人將他放到37度水浴鍋里加熱.一定要注意水浴鍋的衛生,有的常年不清洗,裡面很髒,容易在外面瓶身上吸附大量細菌.因此用它的也一定要勤換水.從水浴鍋那出後,最好找個毛巾擦乾上面的水.
昆蟲杆狀病毒的系統
病毒粒子爲桿菌狀,兩端圓滑,側邊平行,無包膜,一般長度範圍60~900nm,大多爲130nm,直徑30nm,無突起及其他外殼表面結構.
病毒特性
形態學
病毒粒子爲桿菌狀,兩端圓滑,側邊平行,無包膜,一般長度範圍60~900nm,大多爲130nm,直徑30nm,無突起及其他外殼表面結構.[1]?
理化特徵
標準沉降常數S（20W）=200S,在氯化銫中的浮力密度爲1.31g/cm^3.病毒在pH=6~9,4mol/L的NaCl、100mmol/L的EDTA和硫酸銫存在條件下穩定,在室溫下可穩定幾星期,不受氯仿、四氯化碳和非離子型去垢劑影響,但對於正丁醇敏感,在53~55℃10min即失去侵染活性. [1]?
核酸
爲單分子開環狀dsDNA,長7.5~8.0kb.[1]?
蛋白質
病毒含有一個分子質量35~37kDa的主要結構蛋白,一個次要多肽分子質量從33~39kDa大小不等.[1]?
碳水化合物
病毒不含碳水化合物,但可被高碘酸-席夫（Schiff's）試劑染色.[1]?
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基因組
單分體基因組,含有3個ORF.雙鏈DNA的每條鏈上特定位點均含有一個帶單鏈序列的缺口.基因組中含有反向重複序列.鴨跖草黃斑駁病毒DNA的3個ORF編碼蛋白分別爲23kDa、15kDa和216kDa,最大的ORF可能編碼多聚蛋白,隨後切割成幾個功能蛋白,包括一個未知功能蛋白（U）、外殼蛋白和RNA結合蛋白（PB）、天門冬氨酸蛋白酶（PR）、逆轉錄酶（RT）和RNA酶H（RH）.該屬鴨跖草黃斑駁病毒的DNA已測序.[1]?
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抗原特性
病毒是中等免疫原性,一些病毒之間有血清學關係.[1]?
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細胞病理
該屬大多數種的病毒粒子存在於寄主植物的所以組織中,病毒只分布在細胞質中,單個或成羣不規則分布,粒子分散或者排列成柵欄狀,不在內含體或有膜囊泡結構中.[1]?
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生物學
寄主範圍
病毒的自然寄主範圍很有限,常局限於少數幾個特定的植物屬,症狀爲褪綠斑駁.實驗寄主也很少,在自然寄主以外的傳播常常不能成功.[1]?
傳播
該屬絕大部分病毒都不能機械傳播,或傳播很困難.主要通過無性繁殖的寄主植物擴散傳播,自然界中多數種由介體粉蚧以半持久方式傳播,有些病毒也可以種傳或經花粉傳播.[1]?
地理分布
世界性分布,主要在熱帶和亞熱帶地區,病毒的起源地爲東南亞及澳大利亞.[1]?
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分類
該屬有12個種和4個暫定種,代表種是鴨跖草黃斑駁病毒,中國尚無報導.[1]?
確定種
共12個種.[1]?
?中文名 學名? 國際基因庫登錄號碼?
亮絲草杆狀病毒 ?Aglaonema bacillifrom virus（ABV） -
?香蕉線條病毒 ?Banana streak virus（BSV） ?[AJ002234]
?可可樹腫枝病毒 ?Cacao swollen shoot virus（CSSV） ?[L14546]
?美人蕉黃斑駁病毒 ?Canna yellow mottle virus（CaYMV） ?-
?柑橘花葉病毒 ?Citrus mosaic virus（CMBV） ?-
?鴨跖草黃斑駁病毒 ?Commelina yellow mottle virus（ComYMV） ?[X52938]
?薯蕷杆狀病毒 ?Dioscorea bacillifrom virus（DBV） ?[X94575-76]
伽藍菜頂端斑點病毒 ?Kalanchoe top-spotting viurs（KTSV） ?-
?菠蘿杆狀病毒 ?Pineapple bacillifrom virus（PBV） ?-
?胡椒黃斑駁病毒 ?Piper yellow mottle virus（SRV） ?-
?鵝掌柴環斑病毒 ?Schefflera ringspot virus（SRV） ?-
甘蔗杆狀病毒 ? ?Sugarcane bacillifrom virus（SCBV） ?[M89923]
暫定種
共4個種.[1]?
?中文名 學名?
?桃葉珊瑚杆狀病毒 ?Aucuba bacillifrom virus（AuBV）
?含羞草杆狀病毒 ?Mimosa bacillifrom virus（MBV）
?芋杆狀病毒 ?Taro bacillifrom virus（TaBV）
?絲蘭杆狀病毒 ?Yucca bacillifrom virus（YBV）