我要用western檢測一種細胞系中分泌蛋白的表達,eg:細胞因子,是檢測培養液中的蛋白還是細胞抽提物種的呢

題目：

我要用western檢測一種細胞系中分泌蛋白的表達,eg:細胞因子,是檢測培養液中的蛋白還是細胞抽提物種的呢
我個人覺得分泌蛋白是通過分泌到細胞外之後產生作用的,那就應該檢測培養液中的蛋白了,但是又是從細胞中分泌出來的,檢測細胞抽提物中的應該也說得通,那究竟應該以那個為準呢?或者兩個都檢測,研究某種物質對此蛋白的表達量的影響時,兩個地方的蛋白含量變化檢測結果會是一致的嗎?
或者不用western,其它的方法?免疫組化?

解答：

你不妨對細胞內外的蛋白都做一個檢測,但是檢測細胞外的蛋白比較麻煩.因爲培養基的成分本身很複雜.等細胞長滿後用完全培養基培養24小時,然後用PBS洗兩遍,加Hepes溶液,使細胞覆蓋就行.培養2-3天收集培養液離心,濃縮上清至原體積的1/30-1/10,然後做western檢測.如果還檢測不出來就用上述液做個免疫沉澱,然後做western.但這樣就誤差太大,基本看不出來變化.所以建議：（1）以細胞內的蛋白做,刺激時間不要過長.（2）用表達量與此蛋白有直線相關的其他蛋白來代替,比如其信號通路上下游的一些激酶之類的.
再問： 覺得你說的最靠譜，你說濃縮上清至原體積的1/30-1/10，是濃縮離心還是氮吹？這個時間應該有點長，總覺得怕蛋白降解或者不穩定啊。 我看的文獻都是取上清做的，但是沒有說具體操作。 老師的建議是細胞抽提物和上清液同時上樣檢測。怕用細胞抽提物來做與實際表達量的相關性不好，你有沒有見過類似的文獻或者操作protocol的啊？
再答： 我做過類似的實驗。濃縮的時候用的透析袋，但這種做法誤差大。蛋白是降解，但能檢測出來。直接點上清液是沒用的，很難檢測到上清中細胞分泌的蛋白。因爲濃度太小。細胞抽提物可以。不能說沒有相關性，因爲就算是分泌蛋白細胞裡邊還會有的。