H9N2 AIV的NS1基因原核與真核表達及NS1蛋白對幾種細胞凋亡的影響

題目：

H9N2 AIV的NS1基因原核與真核表達及NS1蛋白對幾種細胞凋亡的影響

解答：

摘要5-6 ABSTRACT6-11 第一章 禽流感病毒研究進展11-24 1.1 禽流感概述11-12 1.2 禽流感病毒的一般生物學特性12-14 1.2.1 AIV 的分類地位12 1.2.2 AIV 的形態特徵12-13 1.2.3 AIV 的理化特性13 1.2.4 AIV 的抗原性和基因型變異13-14 1.2.5 AIV 的生態學與流行病學變化14 1.3 AIV 的分子生物學研究進展14-19 1.3.1 AIV 的基因組結構14-15 1.3.2 AIV 基因編碼蛋白的結構和功能15-18 1.3.3 AIV 宿主特異性的分子生物學基礎18-19 1.4 AIV 分子生物學檢測方法研究進展19-21 1.4.1 聚合酶鏈式反應19-20 1.4.2 逆轉錄-環介導等溫核酸擴增技術20-21 1.4.3 基因晶片技術21 1.5 禽流感疫苗研究進展及展望21-23 1.5.1 禽流感全病毒滅活疫苗21-22 1.5.2 基因工程亞單位疫苗22 1.5.3 基因重組活載體疫苗22 1.5.4 核酸疫苗22 1.5.5 具有交叉保護性的通用疫苗22-23 1.5.6 新型疫苗23 1.6 本研究的目的和意義23-24 第二章 H9N2 亞型AIV NS1 基因在大腸桿菌中的表達24-39 2.1 材料24-28 2.1.1 毒株和雞胚24 2.1.2 陽性血清和標準抗原24 2.1.3 載體及菌種24 2.1.4 主要試劑及溶液配製24-28 2.1.5 主要儀器28 2.2 方法28-34 2.2.1 病毒增殖28 2.2.2 PCR 引物的設計與合成28-29 2.2.3 病毒總RNA 的提取29 2.2.4 NS1 基因的RT-PCR29 2.2.5 PCR 產物的純化回收29-30 2.2.6 PCR 產物與T 載體連接30 2.2.7 大腸桿菌感受態細胞的製備30 2.2.8 轉化30-31 2.2.9 克隆化質粒的提取及鑑定31 2.2.10 目的基因與表達載體的連接、轉化及鑑定31-32 2.2.11 重組質粒在大腸桿菌中的表達32 2.2.12 表達蛋白的SDS-PAGE 檢測32-33 2.2.13 表達蛋白的western-blotting 分析33-34 2.3 結果與分析34-37 2.3.1 雞胚接種及病變觀察34 2.3.2 NS1 基因的RT-PCR 擴增34 2.3.3 NS1 基因的克隆34-35 2.3.4 NS1 基因原核重組質粒的酶切鑑定35 2.3.5 NS1 基因測序結果分析35-36 2.3.6 NS1 基因大腸桿菌表達產物的SDS-PAGE 分析36 2.3.7 重組質粒pET-NS1 原核表達產物的Western - blotting 分析36-37 2.4 討論37-38 2.5 小結38-39 第三章 H9N2 亞型AIV NS1 蛋白在293 細胞中的瞬時表達39-48 3.1 材料39-40 3.1.1 病毒39 3.1.2 載體、菌株和細胞系39 3.1.3 工具酶和主要試劑39-40 3.1.4 主要溶液的配製40 3.2 方法40-43 3.2.1 引物設計40-41 3.2.2 病毒總RNA 的提取41 3.2.3 NS1 基因的RT-PCR 擴增41 3.2.4 PCR 產物的純化回收41 3.2.5 PCR 產物與pMD18-T simple 載體連接41 3.2.6 DH5a 大腸桿菌感受態細胞的製備41 3.2.7 連接產物的轉化41 3.2.8 重組質粒的鑑定41-42 3.2.9 AIV NS1 真核重組表達質粒的構建42 3.2.10 AIV NS1 真核重組表達質粒在細胞中的表達42-43 3.2.11 pEGFP-C1-NS1 轉染293 細胞的Western –blotting 檢測43 3.3 結果43-46 3.3.1 NS1 基因的RT-PCR 擴增43-44 3.3.2 NS1 基因的重組質粒PMD-NS1z 構建44 3.3.3 NS1 基因真核重組表達載體pEGFP -NS1 的構建44-45 3.3.4 重組質粒轉染293 細胞後在螢光顯微鏡下的照片45-46 3.3.5 NS1 基因轉染293 細胞瞬時表達產物的Western - blotting 分析46 3.4 討論46-47 3.5 小結47-48 第四章 H9N2 亞型AIV NS1 蛋白對幾種細胞凋亡的影響48-55 4.1 材料48 4.1.1 質粒和細胞系48 4.1.2 主要試劑48 4.2 方法48-50 4.2.1 轉染質粒的提取及其濃度、純度的檢測48-49 4.2.2 NS1 基因真核重組表達質粒瞬時轉染細胞49 4.2.3 凋亡檢測49-50 4.3 結果50-53 4.3.1 目的質粒轉染MDCK 細胞檢測結果50-51 4.3.2 目的質粒轉染Vero 細胞檢測結果51-52 4.3.3 目的質粒轉染293 細胞檢測結果52-53 4.3.4 目的質粒引起幾種細胞凋亡情況分析53 4.4 討論53-54 4.5 小結54-55 結論55-56 參考文獻56-61 縮略詞表61-62 致謝62-63 作者簡介63